un genotipo

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9369 (2023) Citar este artículo

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Las deleciones autosómicas recesivas del gen completo de la nefrocistina-1 (NPHP1) dan como resultado una estructura y función anormales de los cilios primarios. Estas deleciones pueden dar lugar a una enfermedad renal tubulointersticial conocida como nefronoptisis y enfermedades retinianas (síndrome de Senior-Løken) y neurológicas (síndrome de Joubert). La nefronoftisis es una causa común de enfermedad renal terminal (ESKD, por sus siglas en inglés) en niños y hasta el 1% de la ESKD de inicio en adultos. Las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las pequeñas inserciones y deleciones (Indels) se han caracterizado menos. Utilizamos un sistema de puntuación de patogenicidad genética (GenePy) y un enfoque de genotipo a fenotipo en individuos reclutados en el Proyecto de 100 000 genomas de UK Genomics England (GEL) (100kGP) (n = 78 050). Este enfoque identificó a todos los participantes con enfermedades relacionadas con NPHP1 informadas por NHS Genomics Medical Centers y ocho participantes adicionales. Se observaron puntuaciones extremas del gen NPHP1, a menudo respaldadas por una clara herencia recesiva, en pacientes de diversas categorías de reclutamiento, incluido el cáncer, lo que sugiere la posibilidad de una enfermedad más extendida de lo que se creía anteriormente. En total, diez participantes tenían deleciones CNV homocigotas con ocho homocigotas o heterocigotas compuestas con SNV. Nuestros datos también revelan una fuerte evidencia in-silico de que aproximadamente el 44% de las enfermedades relacionadas con NPHP1 pueden deberse a SNV con evidencia de modelado estructural AlphaFold de un impacto significativo en la estructura de la proteína. Este estudio sugiere un subregistro histórico de SNVS en enfermedades relacionadas con NPHP1 en comparación con las CNV.

La nefrocistina-1 (NPHP1) se localizó por primera vez en el cromosoma 2q13 antes de que se encontrara una deleción homocigótica considerable en esta misma región1. Saunier et al. y Hildebrandt et al. identificó NPHP1 dentro del intervalo mínimo de eliminación junto con otro gen, MALL2,3. Ambos observaron variantes adicionales de un solo nucleótido (SNV) en NPHP1 pero no en MALL en pacientes con una deleción heterocigota. Saunier et al. más tarde demostraron que el gen NPHP1 estaba flanqueado por dos repeticiones de copia baja (LCR) invertidas de 358 kilobases (kb) y que ambas incluían una LCR más pequeña de 45 kb, que contenía los puntos de corte de deleción del paciente4.

El cromosoma humano dos ha surgido de la fusión de dos cromosomas ancestrales de grandes simios, y el punto de fusión telómero-telómero se encuentra en 2q13. Los telómeros tienen varias secuencias repetidas, lo que puede explicar la presencia de estos LCR5. Los LCR se encuentran en el 5-15 % del genoma humano y proporcionan un punto en el que puede ocurrir el entrecruzamiento mediado por recombinación homóloga no alélica (NAHR)5,6. Este cruce desigual da como resultado una variación estructural, incluidas las variantes del número de copias (CNV), como duplicaciones, eliminaciones o inversiones5.

NPHP1 se localiza en los cilios de conexión de las células fotorreceptoras y en la base del cilio renal primario (conocida como zona de transición) de las células epiteliales renales de los conductos colectores7,8. Los cilios primarios son orgánulos sensoriales casi ubicuos que sobresalen de la superficie celular9. Por ello, las enfermedades asociadas a NPHP1 se conocen como ciliopatías10.

La deleción homocigota de NPHP1 es la causa más común de nefronoptisis (20-25% de los casos)11,12,13. La nefronoptisis, que significa 'nefrona que desaparece' en griego, es una enfermedad renal tubulointersticial clásicamente dividida en tres categorías, según la edad de presentación: infantil, juvenil y, con menor frecuencia, adolescente14. La ecografía revela riñones de tamaño pequeño a normal, con mayor ecogenicidad debido a la fibrosis y pérdida de la diferenciación corticomedular. Los quistes corticomedulares pequeños pueden desarrollarse más adelante en el curso de la enfermedad debido a la pérdida de tejido normal14. La forma infantil difiere más significativamente de las otras formas con aparición en el útero, oligohidramnios y ERT en los dos primeros años de vida, pero con riñones agrandados en lugar de normales o encogidos y desarrollo de quistes más generalizado15. La nefronoptisis juvenil y adolescente puede estar asociada con poliuria y polidipsia que preceden al desarrollo de la enfermedad renal crónica, así como al retraso del crecimiento14.

Además de la nefronoptisis, el 15% de los pacientes presentan fenotipos de distrofia retiniana (síndrome de Senior-Løken) o neurológicos (síndrome de Joubert)16. El fenotipo retiniano puede ser leve17. El síndrome de Joubert (SJ) se caracteriza por ataxia cerebelosa, retraso mental, hipotonía y desregulación respiratoria neonatal18. La malformación cerebelosa se puede ver en las imágenes de resonancia magnética como el llamado "signo del diente molar" (MTS). Las malformaciones son menos graves en pacientes con mutaciones NPHP1 con JS más leve que con otras causas genéticas18,19,20.

La deleción homocigótica de NPHP1 es totalmente penetrante y, por tanto, patognomónica del fenotipo nefronoptisis11,13. Está bien establecido que la nefronoptisis es una de las principales causas de IRT en niños14. Sin embargo, datos más recientes de Snoek et al. identificó deleciones homocigotas en NPHP1 en el 0,9% de ESKD21 de inicio en adultos. Un individuo llegó por primera vez a ESKD a los 61 años. El 69% de los pacientes tenían un diagnóstico previo diferente a nefronoptisis, enfermedad tubulointersticial o riñón quístico21. Aunque se informó en asociación con nefronoptisis, las pequeñas inserciones y deleciones (indels) y las variantes de un solo nucleótido (SNV) están menos caracterizadas en NPHP122.

Si bien las pruebas de asociación de una sola variante han identificado con éxito variantes comunes de la enfermedad, siguen sin poder suficiente para las variantes raras, incluso con un alto número de casos23. Por lo tanto, aplicamos nuestro sistema de puntuación a nivel de genes, GenePy24. GenePy es un software que transforma datos de nivel de variante en datos de nivel de gen. GenePy genera una puntuación de la patogenicidad del gen completo para cada persona mediante la incorporación de métricas de nocividad in silico, la frecuencia de alelos de la población y la cigosidad observada para cada variante24. El efecto de múltiples variantes dentro de un gen se combina en una sola puntuación de patogenicidad genética acumulada para cada individuo. Las puntuaciones de GenePy son continuas pero no siguen una distribución normal. Las puntuaciones más altas de GenePy son intuitivas a nivel básico, ya que las puntuaciones más altas representan una mayor carga mutacional patogénica debido a mutaciones raras y perjudiciales. Las puntuaciones de GenePy se pueden utilizar como base para priorizar un gran número de variantes candidatas.

El Proyecto 100.000 Genomas (100kGP) de UK Genomics England (GEL), que completó el reclutamiento en 2018, tenía como objetivo secuenciar los genomas de pacientes con cáncer y enfermedades raras y vincular estos datos con registros clínicos digitales. Los objetivos eran mejorar el diagnóstico clínico, adaptar las terapias, permitir nuevos descubrimientos científicos y vincular la investigación con un servicio de medicina genómica clínicamente integrado en el Servicio Nacional de Salud (NHS) del Reino Unido25.

Usando secuenciación del genoma completo y datos clínicos longitudinales del proyecto 100kGP; nuestro objetivo fue identificar la variación patogénica en NPHP1 y los fenotipos asociados utilizando un enfoque de genotipo a fenotipo. Generamos puntajes GenePy para NPHP1 para todos los individuos reclutados en el 100kGP y además incorporamos datos de variación del número de copias (CNV). También cuestionamos la frecuencia de CNV y SNV en individuos reclutados para 100kGP y evaluamos la evidencia de SNV que contribuyen al fenotipo. Aplicamos un primer enfoque de gen o un enfoque de genotipo a fenotipo al considerar los genotipos de todos los individuos reclutados para el 100kGP independientemente de su enfermedad. Luego llevamos a cabo el fenotipado inverso para relacionar el espectro fenotípico asociado con diferentes mutaciones.

El proyecto de 100.000 genomas fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Servicio Nacional de Ética de la Investigación para el Este de Inglaterra—Comité de Ética de Investigación del Sur de Cambridge. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales como parte del estudio original.

El acceso al conjunto de datos GEL para el proyecto (registro de investigación ID 109) fue aprobado por la asociación de interpretación clínica renal GEL (GeCIP), y todos los análisis se realizaron dentro del entorno de investigación GEL. Los pacientes con criterios de elegibilidad definidos por GEL para enfermedades raras o cáncer dieron su consentimiento para la secuenciación del genoma completo de la línea germinal vinculada a los datos del fenotipo clínico, incluidos los registros de salud electrónicos longitudinales. Los datos específicos de la ontología del fenotipo humano (HPO) se recopilaron en el momento del reclutamiento según la categoría de reclutamiento del participante26. Los datos de fenotipo longitudinales adicionales incluyeron la base de datos de estadísticas de episodios hospitalarios (HES) que contiene detalles de todas las citas de admisión, emergencia y ambulatorias en los hospitales del NHS en Inglaterra registradas como códigos ICD-1027. La mayoría de los participantes proporcionó muestras de sangre, aunque un pequeño número proporcionó saliva para la extracción de ADN de la línea germinal. Además del ADN de la línea germinal, algunos participantes reclutados para el grupo de cáncer también proporcionaron ADN de células tumorales somáticas.

Los datos de fenotipo se extrajeron de la versión de datos provisionales v11.028 del programa LabKey Main. Los términos de la ontología del fenotipo humano (HPO) se proporcionaron reclutando centros de medicina genómica (GMC) de acuerdo con el protocolo GEL29.

Los datos genómicos se obtuvieron de un formato agregado de llamada de variante de muestra múltiple (VCF; aggV2) versión principal 11 (17/12/20). Todas las muestras se secuenciaron con lecturas de extremos emparejados de 150 pb en un solo carril de un instrumento Illumina HiSeq X. La salida de secuenciación sin procesar en forma de un archivo de llamada base binaria (BCL) se procesó en el flujo de trabajo de secuenciación del genoma completo de la versión 4 de Illumina North Star (NSV4, versión 2.6.53.23), que comprende el alineador iSAAC (versión 03.16.02.19). y Starling Small Variant Caller (v.2.4.7). Los CNV fueron llamados por la canalización de Genomics England utilizando el software Illumina Canvas30. Las muestras se alinearon con el ensamblaje NCBI Genome Reference Consortium Human Build 38 con secuencias señuelo. Los gVCF de muestra única se agregaron utilizando el genotipador Illumina gVCF (v.2019.02.26).

Se extrajo un gVCF multifuente del gVCF agregado del que se seleccionó el locus del gen NPHP1 (definido mediante NCBI GRCh38/hg38 (chr2:110,123,335–110,205,062)) mediante bcftools 1.631,32.

Las variantes que cumplían con los estándares mínimos de calidad (GQ > 20, GQ medio > 35, DP > 10 y ausencia máxima del 70 %) se identificaron mediante vcftools 0.1.16 y se conservaron para el análisis posterior (n = 12 780)33.

Para generar puntajes de patogenicidad de genes completos, aplicamos el algoritmo GenePy v.1.3 para variantes codificantes y no codificantes24,34. La puntuación GenePy (S) para un gen dado (g) y un individuo (h) es la suma del efecto de todas las variantes (k) donde cada locus de variante bialélica (i) en un gen se pondera de acuerdo con su nocividad predicha (usando CADD(Di), cigosidad y frecuencia alélica global (gnomAD v3.0)) (f).

Luego se anotó el VCF usando ANNOVAR 1.0 para datos de frecuencia de alelos gnomAD_versión 3.0 (f) y la base de datos RefGene de genes35. Se utilizó el agotamiento dependiente de la anotación combinada (CADD) v1.6 para anotar el carácter nocivo (D)36. Limitamos las variantes a aquellos con puntajes CADD PHRED superiores a 15 (n = 214). Se eligió este punto de corte porque representa el valor mediano para todos los posibles cambios de sitio de empalme canónico y variantes no sinónimas en CADD.

El algoritmo GenePy está optimizado para incluir indels y SNV representados en archivos VCF, pero no incorpora sistemáticamente datos CNV. Por lo tanto, se integró una puntuación GenePy para las deleciones del gen completo de CNV de NPHP1 con la puntuación del gen completo mediante la asignación arbitraria de (D) como la puntuación máxima de CADD 1.6 observada para una variante stop-gain dentro del gen NPHP1 y la frecuencia alélica usando la variante estructural v2 de gnomAD (f = 1,798 × 10–3).

Las mutaciones identificadas se modelaron tanto en la base de datos 3D de Missense como utilizando Maestro Suite v13.1 y BioLuminate 4.6 Release 2022-1 (Maestro & BioLuminate, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021)37,38,39,40,41 . Las mutaciones se identificaron como patogénicas siguiendo los siguientes criterios: (1) la sustitución reemplaza un residuo cargado enterrado con un residuo sin carga, (2) la sustitución interrumpe todos los enlaces H de cadena lateral/cadena lateral y/o cadena lateral /enlace(s) de cadena principal, enlaces H, (3) la sustitución rompe todos los enlaces H de cadena lateral/cadena lateral y/o enlaces H de cadena lateral/cadena principal formados por la tipo salvaje que fue enterrado, (4) la sustitución conduce a una expansión o contracción del volumen de la cavidad de ≥ 70 Å3, (5) la sustitución rompe un puente salino formado por el tipo salvaje que fue enterrado. La longitud máxima del enlace N-O es de 5,0 Å.

El enfoque de genotipo a fenotipo que incorporó SNV, indels y CNV en las puntuaciones clasificadas de NPHP1 GenePy identificó fenotipos renales, retinales o neurológicos entre los individuos mejor clasificados (consulte la Tabla 1). Es probable que se sobrestime la edad de aparición de la enfermedad, ya que los datos de HES solo estaban disponibles a partir de la fecha de reclutamiento. En total, 26 participantes fueron identificados con genotipos recesivos bialélicos consistentes con enfermedad monogénica relacionada con NPHP1. Nuestro enfoque identificó dieciocho pacientes con un fenotipo renal o retiniano y un genotipo constante con la enfermedad autosómica recesiva monogénica. Los centros de medicina genómica del NHS han informado previamente sobre ocho de estos. En total, se descubrieron diez deleciones homocigotas de genes completos de CNV de NPHP1. Se identificaron SNV homocigotas o heterocigotas compuestas consistentes con enfermedad monogénica en ocho pacientes con fenotipos renales, retinianos o neurológicos (ver Fig. 1).

Flujo de trabajo bioinformático con números de participantes con genotipos bialélicos para enfermedades monogénicas relacionadas con NPHP1. La comparación del enfoque de genotipo a fenotipo (participantes con y sin fenotipos renales o retinianos penetrantes) y los informados por la tubería clínica GEL están entre paréntesis. Este enfoque era completamente sensible para seleccionar a los individuos, como lo resolvió la canalización de interpretación clínica de GEL en el momento de escribir este artículo.

Todos los SNV e indels tenían frecuencias alélicas menores o iguales a 4 × 10−3 según gnomAD v3.0 y CADD 1.6 PHRED puntuaciones entre 15 y 47 (ver Tabla 2). La evaluación de la patogenicidad de las variantes se llevó a cabo siguiendo las directrices del Colegio Americano de Genética Médica y Genómica (ACMG) y de la Asociación de Patología Molecular para la interpretación de variantes de secuencia42. La secuenciación gradual del genoma completo de GEL no está disponible, y la confirmación en participantes con posibles mutaciones heterocigóticas compuestas requirió el análisis de los genomas originales cuando estuviera disponible. Sin embargo, las mutaciones sin sentido heterocigotas compuestas deben ser in-trans con deleciones de CNV heterocigotas, mientras que las variantes homocigotas no requieren información de fase. La evaluación de los genomas parentales para la segregación de variantes candidatas fue posible en tres casos. El participante nueve posiblemente era heterocigoto compuesto para R668C y S666C; sin embargo, ambas variantes estuvieron presentes en el padre, confirmando presencia en-cis. El participante treinta y tres posiblemente era heterocigoto compuesto para R545K y R444C; sin embargo, ambas variantes estaban presentes en la madre de la participante, lo que confirma la presencia en-cis. Se confirmó que las variantes heterocigóticas compuestas en el participante catorce (R639I y Y78H) segregaban con una variante en cada padre. No se demostró que las variantes fueran de novo. No se predijo que las variantes afectaran el empalme, incluidas muchas variantes intrónicas con puntuaciones CADD de moderadas a altas. En los datos complementarios se incluye una lista de estas variantes, incluidas las variantes patogénicas heterocigóticas y las que no se segregaron o se predijo que eran benignas en ClinVar (consulte la Tabla complementaria 1).

El análisis de CNV reveló 424/78.050 participantes de 344 familias (0,54 %) con deleciones de CNV identificadas en cohortes de cáncer y enfermedades raras. La frecuencia alélica de las deleciones de CNV fue similar en las cohortes de cáncer y enfermedades raras y el doble de la tasa descrita en gnomAD SV v2.1 (consulte la Tabla 3). Esto último puede no ser sorprendente dado que la secuenciación basada en el exoma es más desafiante para llamar a las CNV.

Diez deleciones homocigotas de CNV de diez familias diferentes se clasificaron conjuntamente en veinte en orden descendente de puntuación GenePy. Seis de estos no fueron informados previamente por los centros de medicina genómica GEL. Ocho participantes con deleciones homocigóticas de la CNV tenían insuficiencia renal con ERT (n = 6) o ERC en estadio 4 (n = 2). La edad en el primer fenotipo renal registrado utilizando datos HES ICD-10 o términos HPO de reclutamiento osciló entre 6 y 52 años. Cuatro participantes tenían distrofia retiniana con una edad en el fenotipo retiniano registrado por primera vez que oscilaba entre 25 y 54 años. Un participante no tenía datos de fenotipo disponibles, pero había sido reclutado debido a una "insuficiencia renal inexplicable en los jóvenes", que requería la aparición de ERT antes de los 50 años. Un participante fue reclutado en la cohorte de cáncer para melanoma maligno y tenía ERC con nefritis tubulointersticial y enfermedad renal hipertensiva a los 52 años y distrofia retiniana hereditaria a los 54 años. naturaleza de variante nula de la deleción del gen que proporciona una evidencia muy fuerte de patogenicidad.

Ocho participantes tenían un fenotipo compatible con enfermedad renal o retiniana y SNV homocigotos o heterocigotos compuestos. Estos incluyeron una mutación stop-gain homocigota (dos hermanos de una familia), deleciones CNV heterocigotas con una mutación de sentido erróneo (dos hermanos de una familia), dos mutaciones de sentido erróneo homocigotas diferentes (dos individuos de dos familias) y dos posibles compuestos heterocigotos diferentes. mutaciones missense (dos individuos de dos familias). Se sabía que los participantes con mutaciones homocigóticas de parada ganada y homocigóticas sin sentido y tres de los diez con deleciones homocigóticas de CNV tenían consanguinidad. De estos ocho, los dos hermanos con variantes homocigotas stop-gain podrían informarse como patogénicos según las pautas de ACMG debido a la variante nula. Los otros SNV eran raros (4.00E−04) o nuevas variantes sin sentido con fuerte evidencia in-silico de patogenicidad con puntajes CADD de entre 18 y 28.9.

Otros ocho participantes de ocho familias tenían genotipos recesivos consistentes con una enfermedad monogénica relacionada con NPHP1 pero sin un fenotipo documentado. Estos incluyeron seis con posibles mutaciones de sentido erróneo heterocigotas compuestas y dos deleciones de CNV heterocigotas compuestas in-trans con una mutación de sentido erróneo. Un participante sin un fenotipo renal o retiniano documentado fue reclutado para la cohorte de cáncer. El otro era familiar de un participante reclutado con discapacidad intelectual y sin datos de fenotipo disponibles para enfermedad renal o retiniana.

Se descubrieron muchas deleciones heterocigotas de CNV (n = 414), incluidas seis en las 50 mejores clasificaciones de GenePy. Se identificaron dos deleciones heterocigóticas de la CNV en los participantes reclutados en la cohorte de cáncer, pero no se registró ningún fenotipo renal o retiniano. Sin embargo, las deleciones fueron in-trans con una variante intrónica con una puntuación CADD 1.6 PHRED de 15.56 y se encontraron en una marca potenciadora activa (H3K27ac). El CNVS heterocigoto restante se clasificó conjuntamente en el puesto 593 y no se encontró con ninguna variante patogénica predicha adicional por CADD 1.6.

Para explorar si alguna de las variantes patogénicas o supuestas patogénicas (descritas en la Tabla 2) podría tener un impacto en la integridad estructural de NPHP1, mapeamos los cambios más conspicuos en el modelo estructural de NPHP1 (UNIPROT#O15259) publicado recientemente por AlphaFold43,44 . En resumen, el algoritmo AlphaFold es un sistema de IA basado en el análisis de mapas de contacto de residuos coevolutivos extraídos de múltiples alineaciones de secuencias (MSA) de secuencias, que alimentan dos redes neuronales: una entrenada en estructuras de Protein Data Bank (PDB) para predecir ángulos y distancias interatómicos; otro, entrenado para puntuar la geometría y precisión estructural. Este modelo identifica cinco regiones estructurales diferentes dentro de la cadena polipeptídica de NPHP1 (ver Fig. 2): un dominio N-terminal enriquecido por estructuras helicoidales en espiral (residuos 1 a 100, aproximadamente), una primera región desordenada 1 (residuos 100 a 150 ), un dominio SH3 (r.150 a 210), una segunda región desordenada (210 a 240) y un dominio C-terminal globular rico en láminas beta y hélices alfa (240 a 732). La calidad de la predicción generalmente es consistentemente alta en la mayoría de estas regiones, con la exclusión de las dos regiones desordenadas. Los datos estructurales experimentales están disponibles para el dominio enrollado en espiral N-terminal, como el de la familia de proteínas del dominio BAG, conocido por mediar las funciones antiapoptóticas, y los dominios SH3 que se cree que están involucrados en la adhesión celular45,46.

Modelado Alphafold de variantes de NPHP1. (A) Modelo del polipéptido NPHP1 predicho por AlphaFold y anotado manualmente por las principales regiones predichas. (B) Mapeo de mutaciones identificadas por GenePy dentro del modelo estructural NPHP1. (C) El residuo R683 y su entorno de cadena lateral previsto en el modelo NPHP1. (D) El residuo W683 y su entorno de cadena lateral previsto en el modelo mutante NPHP1-R683W. En (C) y (D) los enlaces H se representan como líneas de puntos cian. (E) Alineación de secuencias múltiples que muestra la conservación de R683 en ortólogos de NPHP1 (principalmente vertebrados); el código de colores varía según el nivel de conservación filogenética, desde variable (cian) y promedio (blanco) hasta conservado (granate).

El modelo estructural de NPHP1 permitió evaluar el emplazamiento y el posible impacto en la estructura de las mutaciones identificadas mediante un predictor de sentido erróneo y Maestro Suite v13.1 y BioLuminate 4.6 Release 2022-1 (Maestro & BioLuminate, Schrödinger, LLC, Nueva York, Nueva York, 2021)37,38,39,40,41. En primer lugar, todas las mutaciones se encontraron ubicadas en regiones que contienen el dominio predicho (Fig. 1B complementaria y Tabla complementaria 2). En segundo lugar, se predijo que la mayoría de las mutaciones no tendrían un impacto significativo en la estructura, excepto M575T y R683W; sin embargo, para M575T se predice un cambio significativo en la cavidad dada la reducción del tamaño de los residuos (no se muestra). Además, para R684W en el otro lado, la predicción sobre el cambio incluye: esta sustitución reemplaza un residuo cargado enterrado con un residuo sin carga (TRP), interrumpe múltiples enlaces H con los residuos P670, D621, Q619 y interrumpe un puente salino formado por el átomo NE de R683 y el átomo OD1 de D621. Junto con una contracción de 90.504 Å3 (Figura complementaria 1C, D; Tabla complementaria 3). Finalmente, confirmamos que R683 estaba conservado filogenéticamente (Fig. 1E complementaria).

Dieciocho participantes fueron identificados con genotipos consistentes con un diagnóstico de enfermedad recesiva relacionada con NPHP1 y fenotipos renales o retinales. De estos, diez participantes con deleciones homocigóticas de NPHP1 podrían considerarse patógenos según las pautas de la ACMG. Ocho pacientes tenían SNV homocigotas y heterocigotas compuestas, incluidas dos variantes heterocigotas de significado incierto (VUS) in-trans con deleciones de CNV. De estos, solo los dos con mutaciones homocigotas stop-ganan pueden clasificarse como patogénicos según los criterios de la ACMG.

Los otros SNV eran raros (4.00E-04) o nuevas variantes sin sentido con fuerte evidencia in-silico de patogenicidad. Las puntuaciones CADD PHRED estaban entre 18 y 28,9. A riesgo de perder algunas variantes causales, elegimos una puntuación CADD de corte de 15 o más. Se eligió este punto de corte porque representa el valor mediano para todos los posibles cambios de sitio de empalme canónico y variantes no sinónimas en CADD. Se predice que las variantes con puntajes CADD PHRED superiores a 15 estarán en el 0,5% superior de las sustituciones más perjudiciales que pueden ocurrir en el genoma humano. Sin embargo, como ocurre con las variantes de sentido erróneo en muchos otros genes, no pueden clasificarse oficialmente como clínicamente patógenas sin ensayos funcionales in vitro o in vivo costosos y que consumen mucho tiempo. Esto plantea un problema más amplio con el cuello de botella de la interpretación clínica que ahora pasa de la genómica de alto rendimiento a la falta de ensayos funcionales de alto rendimiento para confirmar la patogenicidad. Dado que estas variantes son raras o incluso privadas para una familia específica, es probable que el costo de desarrollar "estudios funcionales in vitro o in vivo bien establecidos" sea prohibitivo y resulte en una pérdida del beneficio traslacional para los pacientes y sus familias. Cuando se dispone de pruebas experimentales funcionales, estas respaldan las funciones de algunos dominios proteicos en la apoptosis y la adhesión celular45,46. El modelado estructural AlphaFold de estos SNV también predijo un impacto significativo en la estructura de la proteína.

Otros ocho participantes tenían un genotipo SNV recesivo consistente con una enfermedad monogénica relacionada con NPHP1, pero sin fenotipo renal o retiniano documentado. Uno fue reclutado con cáncer y tres eran parientes 'no afectados'. En general, los datos de fenotipo son escasos para los participantes reclutados para el cáncer y para los participantes de enfermedades raras que no sean el probando. El proceso de reclutamiento de GEL para participantes con cáncer no requiere rutinariamente la documentación de la función renal, aunque esto invariablemente se habría probado en todos los pacientes que reciben tratamiento para su cáncer. Los parientes 'no afectados' sin fenotipo registrado en el momento del reclutamiento y sin datos ICD-10 HES longitudinales podrían deberse a que no están clínicamente evaluados, tienen enfermedad subclínica o tienen una enfermedad clínica que no está documentada, que puede presentarse más tarde o no está completamente penetrante

Al evaluar la heterocigosidad compuesta, la dificultad es que algunas variantes pueden estar en el mismo cromosoma. Actualmente, esto no se puede evaluar con datos de lectura corta como los utilizados por Genomics England. Confirmamos la presencia in-trans en un participante a través de la evaluación de los padres. Su corta edad puede explicar la falta de datos de fenotipo para probandos con variantes heterocigóticas compuestas. Todavía pueden desarrollar una enfermedad significativa en su vida (dos tenían menos de 15 años). Datos basados ​​en matrices sobre deleciones homocigotas de CNV de NPHP1 de Snoek et al. sugiere que es posible que los individuos no alcancen la enfermedad renal en etapa terminal hasta la séptima década21. Se requerirá un seguimiento longitudinal de estos participantes utilizando datos HES de GEL para aclarar la penetrancia y confirmar otros casos.

El gran número de participantes en el proyecto 100kG ofreció una oportunidad única para identificar el espectro completo de variación patógena en NPHP1 y enfermedades relacionadas. Por lo tanto, aplicamos un enfoque más objetivo y agnóstico de genotipo a fenotipo. Un beneficio significativo sobre un enfoque de casos y controles es que evita la necesidad de excluir a los participantes de los análisis basados ​​en la ascendencia o la relación predicha. Esto es particularmente importante dada la subrepresentación de individuos de ascendencia no europea en la literatura genética. Al igual que con todos los enfoques que implementan datos de lectura breve, este enfoque está sujeto a las mismas limitaciones. Esto incluye sensibilidad reducida para detectar variantes en regiones altamente variables y ausencia de representación de fase. La falta de datos de fase es particularmente problemática en la enfermedad de inicio en adultos donde el ADN original puede no estar disponible para determinar la cigosidad, lo que limita la capacidad de evaluar variantes heterocigotas compuestas. Al igual que con todos los datos a gran escala, la puntuación de GenePy depende de la calidad de los datos y de la eliminación de sesgos sistemáticos y artefactos técnicos. Sin embargo, los datos genómicos de Inglaterra utilizados fueron de alta integridad, con todas las muestras secuenciadas con lecturas de extremos emparejados de 150 pb en un solo carril de Illumina HiSeq X.

Nuestros datos respaldan el beneficio de un primer enfoque genético que permite la identificación de genotipos y fenotipos asociados sin sesgo con respecto a su fenotipo. Este enfoque se puede aplicar a cualquier gen e incluye participantes que aún pueden desarrollar la enfermedad. En particular, el enfoque de genotipo-fenotipo no pasó por alto ningún individuo informado como resuelto por la tubería de interpretación clínica GEL en el momento de escribir este artículo. De acuerdo con los datos del cuestionario de salida de GMC, GEL informó sobre nueve participantes de siete familias utilizando la canalización de interpretación clínica. Sin embargo, se informó uno para otro gen retinal (PDE6B) distinto de NPHP1. Esto destaca la posibilidad de que algunos participantes tengan más de un diagnóstico molecular monogénico. En un estudio de exoma completo de 7374 pacientes, 101 (4,9 %) tenían diagnósticos que involucraban más de un locus, y los fenotipos asociados podían ser distintos o superpuestos47. Se sabía que todos los pacientes con más de un diagnóstico genético eran consanguíneos.

Las deleciones CNV homocigotas de NPHP1 son una causa bien definida de insuficiencia renal. Sin embargo, la contribución de SNV e indels a la enfermedad renal y retiniana está menos caracterizada. Este estudio sugiere que las variantes patógenas de NPHP1 son más comunes de lo estimado previamente y que las SNV pueden representar hasta el 44 % de los diagnósticos de enfermedades monogénicas relacionadas con NPHP1. Esto puede representar una estimación conservadora ya que los participantes sin fenotipo renal o retiniano registrado (debido a su corta edad o falta de identificación) aún pueden demostrar estos fenotipos.

El enfoque del gen primero (genotipo a fenotipo) combinado con una puntuación de patogenicidad génica (GenePy) permitió la identificación del espectro genético molecular completo de la nefrocistina-1 (NPHP1) en el proyecto de 100.000 genomas del Reino Unido, independientemente de la relación o la ascendencia. Los datos de apoyo del modelo estructural AlphaFold sugieren que hasta el 44 % de los diagnósticos de enfermedades relacionadas con NPHP1 pueden ser causados ​​por SNV además de las deleciones de CNV bien descritas. Se espera que el aumento de la disponibilidad de datos genómicos por fases de la secuenciación de lectura larga aumente el poder de este enfoque y permita una evaluación segura de las variantes heterocigóticas compuestas. El seguimiento longitudinal proporcionará datos sobre la capacidad de predecir futuros estados de enfermedad en individuos con una puntuación alta en GenePy.

Los datos completos están disponibles en Genomic England Secure Research Environment. El acceso se controla para proteger la privacidad y la confidencialidad de los participantes en el Proyecto Genomics England 100,000 Genomes y para cumplir con el consentimiento otorgado por los participantes para el uso de sus datos genómicos y de atención médica. Se permite el acceso a los datos completos a los investigadores después de registrarse en Genomics England Clinical Interpretation Partnership (GeCIP) (https://www.genomicsengland.co.uk/about-gecip/for-gecip-members/data-and-data-access /) y poniéndose en contacto con el autor correspondiente a petición razonable.

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Esta investigación fue posible gracias al acceso a los datos y hallazgos generados por el Proyecto 100,000 Genomas. El Proyecto 100.000 Genomas está gestionado por Genomics England Limited (una empresa de propiedad absoluta del Departamento de Salud y Atención Social). El Proyecto 100,000 Genomas está financiado por el Instituto Nacional de Investigación en Salud y el NHS de Inglaterra. Wellcome Trust, Cancer Research UK y Medical Research Council también han financiado infraestructuras de investigación. El Proyecto 100.000 Genomas utiliza los datos proporcionados por los pacientes y recopilados por el Servicio Nacional de Salud como parte de su atención y apoyo. David Rinaldo por sus valiosos consejos con el modelado usando la suite Maestro & BioLuminate (Schrodinger, NY). Los análisis de las variantes del número de copias en NPHP1 fueron realizados inicialmente por el Dr. Guillermo del Angel, Alexion Pharmaceuticals Inc. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR) del Centro de Investigación Biomédica de Southampton. Las opiniones expresadas son las del autor(es) y no necesariamente las del NIHR o el Departamento de Salud y Atención Social.

Una lista de autores y sus afiliaciones aparece al final del documento.

Universidad de Southampton, Edificio Duthie (MP 808), Hospital General de Southampton, Tremona Road Shirley, Southampton, SO16 6YD, Reino Unido

Gary Leggatt, Guo Cheng, Sumit Narain, Christine Gast, Rodney D. Gilbert y Sarah Ennis

Medetia, Instituto Imagine de Enfermedades Genéticas, 24 Boulevard du Montparnasse, 75015, París, Francia

Luis Briseño-Roa y Jean-Philippe Annereau

Wessex Kidney Centre, Portsmouth Hospitals University NHS Trust, Southwick Hill Road, Cosham, Portsmouth, PO6 3LY, Reino Unido

Gary Leggatt y Christine Gast

Hospital Infantil de Southampton, Hospital General de Southampton, Tremona Road Shirley, Southampton, SO16 6YD, Reino Unido

rodney d gilbert

University Hospital Southampton NHS Foundation Trust, Southampton General Hospital, Tremona Road Shirley, Southampton, SO16 6YD, Reino Unido

Gary Leggatt

Genómica Inglaterra, Londres, Reino Unido

JC Ambrose, P. Arumugam, R. Bevers, M. Bleda, F. Boardman-Pretty, CR Boustred, H. Brittain, MA Brown, MJ Caulfield, GC Chan, A. Giess, A. Hamblin, S. Henderson, TJP Hubbard, R. Jackson, LJ Jones, D. Kasperaviciute, M. Kayikci, A. Kousathanas, L. Lahnstein, A. Lakey, SEA Leigh, IUS Leong, FJ Lopez, F. Maleady-Crowe, M. McEntagart, F. Minneci, J. Mitchell, L. Moutsianas, M. Mueller, N. Murugaesu, AC Need, P. O'Donovan, CA Odhams, C. Patch, D. Perez-Gil, MB Pereira, J. Pullinger, T. Rahim , A. Rendon, T. Rogers, K. Savage, K. Sawant, RH Scott, A. Siddiq, A. Sieghart, SC Smith, A. Sosinsky, A. Stuckey, M. Tanguy, AL Taylor Tavares, ERA Thomas, SR Thompson, A. Tucci, MJ Welland, E. Williams, K. Witkowska, SM Wood y M. Zarowiecki

Instituto de Investigación William Harvey, Universidad Queen Mary de Londres, Londres, EC1M 6BQ, Reino Unido

Boardman-Pretty F, Caulfield MJ, Henderson S, Jones LJ, Kasperaviciute D, Moutsianas L, Mueller M, Need AC, Patch C, Sosinsky A, Thomas ERA, Tucci K, Witkowska y SM Wood

Universidad de East Anglia, Norwich, Reino Unido

JN Griffin

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El análisis y la interpretación de los datos de secuenciación del genoma completo fueron realizados principalmente por GL, GC, SN y SEGL prepararon las tablas 1, 2 y 3 y la tabla complementaria 1. LBR y JPALBR prepararon la figura complementaria 1 y las tablas complementarias proporcionaron experiencia en proteómica. 2 y 3. La perspectiva clínica fue proporcionada por GL, CG y RDG El manuscrito fue escrito por GL y LBR, con aportes de todos los demás autores.

Correspondencia a Gary Leggatt.

JPA y LBR son accionistas de Medetia Pharmaceuticals; JPA y LBR son autores de la solicitud de patente WO2109/075369A1, actualmente en fase de examen nacional PCT. No existen otros conflictos de interés.

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Reimpresiones y permisos

Leggatt, G., Cheng, G., Narain, S. et al. Un enfoque de genotipo a fenotipo sugiere una subnotificación de variantes de un solo nucleótido en enfermedades relacionadas con la nefrocistina-1 (NPHP1) (proyecto UK 100,000 Genomes). Informe científico 13, 9369 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32169-4

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Recibido: 26 Agosto 2022

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32169-4

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